Het Ammoniak-mysterie

br />
Afvalwater zuiveren is een hele klus. Belangrijk is dat ammonium, een stof die veel voorkomt in huishoudelijk en industrieel afvalwater, eruit wordt gehaald. Ammoniumhoudend afvalwater op het oppervlaktewater lozen is schadelijk voor het milieu. Het veroorzaakt zure regen, en maakt sloten te voedselrijk waardoor dikke lagen kroos de vissen verdrijven.

Ammonium – in de volksmond ammoniak – is een restproduct bij de verbranding van eiwitten, en is een verbinding van stikstof en waterstof. Het zit bijvoorbeeld in urine en dat verklaart waarom kattenpis zo naar ammoniak ruikt.

Afvalwaterzuiveraars kenden tot nu toe slechts één manier om ammonium uit het vuile water halen. Deze methode, nitrificatie en denitrificatie genoemd, maakt gebruik van bacteriën. Deze worden op het ammoniumhoudende water losgelaten om de stof om te zetten in stikstof. Dat gebeurt in twee stappen. Eerst wordt het ammonium door een bepaalde groep bacteriën omgezet in nitraat. Als deze eerste groep bacteriën, de nitrificeerders, uitgegeten is, kan de tweede groep aan tafel. Deze groep zet het nitraat om in stikstof. En dat staat weer bij veel verschillende bacteriën op het menu. Stikstofgas kan geen kwaad: meer dan tachtig procent van de aardse atmosfeer bestaat eruit. Nadeel is echter dat deze methode nogal omslachtig is. Het kan sneller.
Mysterieus

Al in 1977 werd berekend dat er waarschijnlijk een bacteriegroep bestaat die, met behulp van nitriet, ammonium onder zuurstofloze omstandigheden direct oxideert tot stikstofgas. Deze bacterie was alleen nog niet gevonden. Totdat, negen jaar later, in de laboratoria van Gist Brocades in Delft plotseling een vreemd verschijnsel werd waargenomen. Bij een proefopstelling voor de zuivering van industrieel afvalwater verdween er opeens ammonium. In een anaërobe omgeving, zuurstofloos dus. Misschien was nu de in 1977 voorspelde bacterie gevonden.

Van de Graaf, toentertijd aio bij het Kluyverlaboratorium van Biotechnologie, kreeg opdracht het verschijnsel uit te zoeken. ,,Gist Brocades droeg dit project over aan de TU omdat het bedrijf zelf geen fundamenteel onderzoek verricht. Een groot probleem was het overbrengen van de proefopstelling, de pilot plant. Je moet je voorstellen dat zo’n pilot plant een kleine, continu werkende afvalwaterzuiveringsinstallatie is. Iedere conditionele verandering kan het proces waarin het verschijnsel zich voordoet, verstoren. Het duurde daarom meer dan een jaar voordat alles weer op gang was en het feitelijke onderzoek kon beginnen.”

Alle omstandigheden waaronder de mysterieuzeammoniakverdwijning in de zuiveringskolommen van Gist Brocades was waargenomen, moesten gereconstrueerd worden. Daarna begon het onderzoek naar het Anaërobe ammonium oxidatie-proces ofwel Anammox. Van de Graaf: ,,Toen ik eraan begon, waren er nog veel mensen die er niet in geloofden. Het verschijnsel werd verklaard als iets chemisch, het resultaat van slecht uitgevoerde proeven of metingen. De uitdaging was aan te tonen dat wel degelijk bacteriën – zoals wij dachten – verantwoordelijk waren voor het proces.”
Antibiotica

Om de rol van de bacteriën aan te tonen moest bewezen worden dat het Anammox-proces biologisch van aard was. Van de Graaf liet verschillende antibiotica op de proefopstelling los en deed proeven met radioactieve bestraling. De bacteriën, die hiertegen niet bestand zijn, legden het loodje en het proces van ammoniumomzetting stopte.

,,Om met meer zekerheid iets over het proces te kunnen zeggen, was het nodig de bacteriepopulatie op te hopen. Daarvoor moest een ophopingscultuur worden gemaakt. Daarin zit zo’n tachtig procent van een bepaalde soort bacterie. Als je zo’n cultuur hebt, kun je een stikstofbalans opstellen en bepalen of het Anammox-proces ook echt werkt, en of deze bacterie daarvoor verantwoordelijk is. Dat lukte”, aldus Van de Graaf.

De scheikundige heeft in totaal vijf jaar aan het onderzoek gewerkt. ,,Het was een onderzoek met een hoog risico. We zijn vanaf niets begonnen. ‘Bij het meten in een pilot plant verdwijnt er iets en zoek maar uit wat het is’ – daar kwam het op neer. Vergelijk het met een black box. Wat er in het proces zelf gebeurt, is een groot raadsel.”
Groeisnelheid

,,De resultaten lieten bovendien vrij lang op zich wachten. Daarnaast had het starten van het proces nogal lang geduurd. Omdat de resultaten, toen ze eenmaal kwamen, veelbelovend waren en omdat de toepassingsmogelijkheden van het Anammox-proces groot leken, werd een jaar verlenging verleend.”

Een belangrijke reden voor het langzaam vrijkomen van resultaten was ook de geringe groeisnelheid van de bacteriën. Van de Graaf: ,,Ik heb ooit ergens als stelling bij een proefschrift gelezen dat de duur van het promotieonderzoek minstens zo lang zou moeten zijn als het omgekeerde van de groeisnelheid van het organisme. Dan zou ik toch wel zo’n dertig jaar bezig mogen zijn.”

Dertig jaar heeft het niet hoeven duren, want recent verkreeg Van de Graaf haar doctorstitel, acht jaar na haar eerste metingen aan het proces. ,,Toen ik klaar was met het onderzoek moest er nog wel een proefschrift geschreven worden. Inmiddels had ik een leuke baan gekregen bij het newMetropolis science and technology center. Het schrijven is dus vooral in avonduren, weekenden en vakanties gebeurd. Hoewel dit moeilijk was, heb ik geen moment gedacht het maar te laten zitten. Het gaat toch om de erkenning van je werk. Je wilt niet dat iemand anders ermee gaat pronken.”

Het onderzoek is met Van de Graafs promotie echter niet afgelopen. Tot op heden is het namelijk niet gelukt deAnammoxeerder (de bacterie) volledig van zijn omgeving los te maken. Van de Graaf: ,,Voor een microbioloog is het het ‘ultieme’ om het beest, de bacterie, dat verantwoordelijk is voor de reactie te isoleren. Daar zijn nu een postdoc en enkele aio’s mee bezig. Iedereen pakt een tak van het onderzoek. Het is een goed gevoel grondlegger van dit onderzoek te zijn.”

Dankzij een Delftse vinding moet het afvalwater sneller en goedkoper te zuiveren zijn. Dr.ir. Astrid van de Graaf promoveerde vorige week op het bacteriële proces dat hiervoor de basis vormt.

Afvalwater zuiveren is een hele klus. Belangrijk is dat ammonium, een stof die veel voorkomt in huishoudelijk en industrieel afvalwater, eruit wordt gehaald. Ammoniumhoudend afvalwater op het oppervlaktewater lozen is schadelijk voor het milieu. Het veroorzaakt zure regen, en maakt sloten te voedselrijk waardoor dikke lagen kroos de vissen verdrijven.

Ammonium – in de volksmond ammoniak – is een restproduct bij de verbranding van eiwitten, en is een verbinding van stikstof en waterstof. Het zit bijvoorbeeld in urine en dat verklaart waarom kattenpis zo naar ammoniak ruikt.

Afvalwaterzuiveraars kenden tot nu toe slechts één manier om ammonium uit het vuile water halen. Deze methode, nitrificatie en denitrificatie genoemd, maakt gebruik van bacteriën. Deze worden op het ammoniumhoudende water losgelaten om de stof om te zetten in stikstof. Dat gebeurt in twee stappen. Eerst wordt het ammonium door een bepaalde groep bacteriën omgezet in nitraat. Als deze eerste groep bacteriën, de nitrificeerders, uitgegeten is, kan de tweede groep aan tafel. Deze groep zet het nitraat om in stikstof. En dat staat weer bij veel verschillende bacteriën op het menu. Stikstofgas kan geen kwaad: meer dan tachtig procent van de aardse atmosfeer bestaat eruit. Nadeel is echter dat deze methode nogal omslachtig is. Het kan sneller.
Mysterieus

Al in 1977 werd berekend dat er waarschijnlijk een bacteriegroep bestaat die, met behulp van nitriet, ammonium onder zuurstofloze omstandigheden direct oxideert tot stikstofgas. Deze bacterie was alleen nog niet gevonden. Totdat, negen jaar later, in de laboratoria van Gist Brocades in Delft plotseling een vreemd verschijnsel werd waargenomen. Bij een proefopstelling voor de zuivering van industrieel afvalwater verdween er opeens ammonium. In een anaërobe omgeving, zuurstofloos dus. Misschien was nu de in 1977 voorspelde bacterie gevonden.

Van de Graaf, toentertijd aio bij het Kluyverlaboratorium van Biotechnologie, kreeg opdracht het verschijnsel uit te zoeken. ,,Gist Brocades droeg dit project over aan de TU omdat het bedrijf zelf geen fundamenteel onderzoek verricht. Een groot probleem was het overbrengen van de proefopstelling, de pilot plant. Je moet je voorstellen dat zo’n pilot plant een kleine, continu werkende afvalwaterzuiveringsinstallatie is. Iedere conditionele verandering kan het proces waarin het verschijnsel zich voordoet, verstoren. Het duurde daarom meer dan een jaar voordat alles weer op gang was en het feitelijke onderzoek kon beginnen.”

Alle omstandigheden waaronder de mysterieuzeammoniakverdwijning in de zuiveringskolommen van Gist Brocades was waargenomen, moesten gereconstrueerd worden. Daarna begon het onderzoek naar het Anaërobe ammonium oxidatie-proces ofwel Anammox. Van de Graaf: ,,Toen ik eraan begon, waren er nog veel mensen die er niet in geloofden. Het verschijnsel werd verklaard als iets chemisch, het resultaat van slecht uitgevoerde proeven of metingen. De uitdaging was aan te tonen dat wel degelijk bacteriën – zoals wij dachten – verantwoordelijk waren voor het proces.”
Antibiotica

Om de rol van de bacteriën aan te tonen moest bewezen worden dat het Anammox-proces biologisch van aard was. Van de Graaf liet verschillende antibiotica op de proefopstelling los en deed proeven met radioactieve bestraling. De bacteriën, die hiertegen niet bestand zijn, legden het loodje en het proces van ammoniumomzetting stopte.

,,Om met meer zekerheid iets over het proces te kunnen zeggen, was het nodig de bacteriepopulatie op te hopen. Daarvoor moest een ophopingscultuur worden gemaakt. Daarin zit zo’n tachtig procent van een bepaalde soort bacterie. Als je zo’n cultuur hebt, kun je een stikstofbalans opstellen en bepalen of het Anammox-proces ook echt werkt, en of deze bacterie daarvoor verantwoordelijk is. Dat lukte”, aldus Van de Graaf.

De scheikundige heeft in totaal vijf jaar aan het onderzoek gewerkt. ,,Het was een onderzoek met een hoog risico. We zijn vanaf niets begonnen. ‘Bij het meten in een pilot plant verdwijnt er iets en zoek maar uit wat het is’ – daar kwam het op neer. Vergelijk het met een black box. Wat er in het proces zelf gebeurt, is een groot raadsel.”
Groeisnelheid

,,De resultaten lieten bovendien vrij lang op zich wachten. Daarnaast had het starten van het proces nogal lang geduurd. Omdat de resultaten, toen ze eenmaal kwamen, veelbelovend waren en omdat de toepassingsmogelijkheden van het Anammox-proces groot leken, werd een jaar verlenging verleend.”

Een belangrijke reden voor het langzaam vrijkomen van resultaten was ook de geringe groeisnelheid van de bacteriën. Van de Graaf: ,,Ik heb ooit ergens als stelling bij een proefschrift gelezen dat de duur van het promotieonderzoek minstens zo lang zou moeten zijn als het omgekeerde van de groeisnelheid van het organisme. Dan zou ik toch wel zo’n dertig jaar bezig mogen zijn.”

Dertig jaar heeft het niet hoeven duren, want recent verkreeg Van de Graaf haar doctorstitel, acht jaar na haar eerste metingen aan het proces. ,,Toen ik klaar was met het onderzoek moest er nog wel een proefschrift geschreven worden. Inmiddels had ik een leuke baan gekregen bij het newMetropolis science and technology center. Het schrijven is dus vooral in avonduren, weekenden en vakanties gebeurd. Hoewel dit moeilijk was, heb ik geen moment gedacht het maar te laten zitten. Het gaat toch om de erkenning van je werk. Je wilt niet dat iemand anders ermee gaat pronken.”

Het onderzoek is met Van de Graafs promotie echter niet afgelopen. Tot op heden is het namelijk niet gelukt deAnammoxeerder (de bacterie) volledig van zijn omgeving los te maken. Van de Graaf: ,,Voor een microbioloog is het het ‘ultieme’ om het beest, de bacterie, dat verantwoordelijk is voor de reactie te isoleren. Daar zijn nu een postdoc en enkele aio’s mee bezig. Iedereen pakt een tak van het onderzoek. Het is een goed gevoel grondlegger van dit onderzoek te zijn.”